<<
>>

МЕТОДИ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТИХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ

Вопросы для подготовки по теме

Понятие о культуре и чистой культуре микроорганизмов. Колонии микроорганизмов.

Популяция, клон, штамм.

Значение чистых культур в микробиологической практике.

Культуры микроорганизмов - это популяции клеток, выросших на стерильной питательной среде.

Популяции могут состоять из разных видов микробов и тогда культуры называются смешанными. Если популяция содержит лишь один вид микроба, культура называется чистой. Чистую культуру выделяют путем получения потомства одной клетки. Культура может расти в виде отдельных колоний на плотной питательной среде. При густом посеве колонии дают сливной рост на плотной среде. Колония микроорганизмов - это сообщество клеток одного вида, возникшее из одной или нескольких особей как правило на плотной питательной среде. Колонии грибов могут возникать и на жидких питательных средах. Поддерживать чистые культуры можно на плотных и жидких питательных средах.

Чтобы получить из смешанной культуры чистую, прибегают к методу накопительной культуры, т.е. культуры, обогащенной необходимым видом микроба. Накопительные культуры получают, создавая элективные условия для их выращивания, т.е. условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенной группы или вида микроорганизмов. При создании элективных условий учитывают особенности физиологии и обмена веществ микробов, их требования к источникам питания, отношение к pH среды, аэрации, температуре, способность к образованию эндоспор и др. Элективные условия не всегда оптимальны для роста учитываемой группы микроорганизмов, но все же они лучше переносятся ими, чем сопутствующими формами.

Выделение чистых КУЛЬТУР аэробных микроорганизмов

Методы выделения чистых культур микробов можно подразделить на две основные группы: а) методы,основанные на принципе механического разделения микробов; б) методы, основанные на биологических особенностях микроорганизмов.

Методы механического разделения микробов.

Метод последовательных разведений по Пастеру.

Берут ряд пробирок с жидкой питательной средой, в первую вносят исследуемый материал, далее, перенося из пробирки в пробирку определенный объем жидкости, получают ряд серийных разведений.

При этом в первых пробирках будет содержаться большое количество микробных клеток, а в одной из последних теоретически может находиться одна клетка. Создав условия для роста и размножения микробов в этой пробирке можно получить чистую культуру.

В других же пробирках будет расти смесь микробов. Этот метод в чистом виде в настоящее время почти не применяется.

Метод Коха. Берут 8-Ю пробирок с 9 мл стерильного расплавленного и охлажденного до 50° агара. I мл исследуемого материала вносят в первую пробирку, хорошо перемешивают, затем I мл из первой пробирки переносят во вторую и т.д., т.е. готовят ряд последовательных разведений. Затем агар из проби-

рок выливают в стерильные чашки Петри, которые после застывания агара помещают в термостат с соответствующей температурой. Каждая живая клетка, попавшая в агар7начнет размножаться и образует колонию. В чашках, содержащих большое количество бактерий, будет наблюдаться обильный рост, колонии будут сливаться, и чистую культуру получить на таких чашках трудно. В последующих разведениях будут образовываться отдельные колонии, из которых легко выделить чистую культуру.

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На первую петлей или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель переносят на другую чашку и втирают оставшихся на шпателе микробов в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят на третью чашку и аналогичным образом производят посев. На первой чашке вырастет макримальное количество колоний, на третьей - наименьшее. В зависимости от содержания микробных клеток в ис-следуемом материале на одной из чашек разовьются отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры микроорганизма.

Рассев петлей.

Метод принципиально не отличается от предыдущего, но более экономичен. Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Отжатую петлю исследуемого материала вносят в первый сектор и проводят этой петлей параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения

по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток,рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах, куда попало небольшое количество клеток, разовьются отдельные колонии.

Метод фильтрации основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине.

Этот метод применяется главным образом для очистки вирусов от бактерий.

Метод получения одноклеточной культуры- с помощью микроманипулятора. Все описанные выше методы не гарантируют получения чистой культуры как потомства одной бактериальной клетки, поскольку колонии, развивающиеся из одной, двух или более близко расположенных клеток практически неразличимы. Для получения чистой культуры рассев следует повторить несколько раз для выявления возможного загрязнения.. Однако существуют методы, позволяющие получить потомство одной единственной бактериальной клетки. Один из них - предусматривает использование микроманипулятора. Это прибор, с помощью которого под контролем глаза через микроскоп можно захватить одну микробную клетку и перенести ее'в питательную среду.

Выделение одноклеточной культуры в висячей капле является другим методом, позволяющим получить потомство одной микробной клетки. Для этого на покровное стекло с помощью стерильного чертежного пера наносят несколько капель суспензии

микробных клеток в питательной среде. Диаметр капли около I мм. Концентрацию клеток подбирают таким образом, чтобы в некоторых каплях содержалась одна микробная клетка.

Покровное стекло с нанесенными каплями используют для приготовления препарата "висячая капля". Чтобы жидкость не высохла, на дно лунки помещают каплю воды, а края покровного стекла смазывают вазелином. Под микроскопом находят и отмечают на рисунке капли, содержащие одну клетку. Создают условия для роста микробной культурі. При необходимости поддерживать температуру выше комнатной используют специальный нагревательный столик, который помещается на •. предметный столик микроскопа. Под микроскопом наблюдают развитие микроколонии из одной клетки. Когда колония разовьется, ее осторожно переносят с помощью узкой полоски стерильной фильтровальной бумаги в питательную среду.

Методы выделения чистых КУЛЬТУР по биологическимсвойствам

Метод Шукевича заключается.в посеве исследуемого материала в конденсационную воду косого агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются на агар, как бы вползают на его поверхность. Отсевая верхние края культурі в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру.

Метод прогревания исследуемого материала позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают на водяной бане при 80° 10-15 мин. При этом погибают вегетативные формы, а спорі остаются невредимыми и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.

Бактериостатический метод основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Определенные вещества угнетают рост одних микробов и не оказывают влияния на другие. Например, небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микробов и не вли-яют на грамотрицательные. Смесь пенициллина и стрептомицина позволяет освободить грибы и дрожжи от бактериальной флорі.

5% раствор серной кислоты быстро убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях и дает рост.

Метод обогащения предусматривает посев исследуемого материала на элективные питательные среды, способствующие росту определенного вида микроба.

Все другие виды или совсем не растут на такой среде, или их развитие идет настолько медленно, что они подавляются ростом того микроба, для которого создана элективная среда . (Примеры использования этого метода приведены в разделе 141).

Метод заражения лабораторных животных или растений применяется н целях выделения и идентификации патогенных микробов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения

по,

подбирают наиболее восприимчивые к предлагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений. После появления у зараженных организмов признаков заболевания производят посев их органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным (см. также раздел 15).

Цель работы: выделить чистые культуры из смеси микроорганизмов методом рассева петлей.

Материалы: культуры микроорганизмов: взвесь с концентра

цией микробных клеток 50 млн/мл, содержащая смесь культур: St.aureus, E.coli; St.aureus,

Вас.subtilis; Serratia marcescens, Вас.

subtilis и-т.п., чашки Петри и пробир

ки с МПА.

Делают препараты окрашенных по Граму клеток, чтобы убедиться, что взвесь содержит смесь микроорганизмов. Рассевают взвесь на чашке, как это указано выше. Инкубируют 5-7 дней при 37°С. Наблюдают результаты посева. Описывают отдельные колонии, обращая внимание на их отличительные особенности: окраску, форму, размер, консистенцию и т.д. Из отдельных колоний готовят окрашенные по Граму препараты, чтобы убедиться, что колонии содержат чистую культуру микроорганизмов. Отсевают микроор- ганизмы из тех же колоний, из которых брали материал для микрос- копирования, на пробирки с МПА. Выращивают при 37° 24 часа. Снова готовят препараты, окрашенные по Граму, чтобы проверить чис-тоту полученной культуры.

Культивирование и выделение чистых КУЛЬТУР анаэробов

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал ( rHg) среды, создать условия анаэробиоза, т.е.

пониженного- содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением фи-зических, химических и биологических методов.

Физические методы основаны на выращивании микроорганиз-

мов в безвоздушной среде, что достигается:

Посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества.

Посевом микробов в глубину плотных питательных сред.

Механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращивают анаэробные микроорганизмы.

Заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.

Посев в среды е редуцирующими веществами. В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5г) животных или растительных тканей (печень, мозг,почки,селезенка, кровь,картофель, вата). Эти ткани, связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерий.

Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазелинового масла. Высота слоя масла в пробирке около I см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китт-Тароцци. Она содержит концентрированный мясо-пептонный бульон с 0,5-1% глюкозы, 0,15% агара и кусочйи свежевареных тканей животных (печень). Сверху среду заливают вазелиновым маслом. Эта среда используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

Посев микробов в глубину плотных соед производится по способу Виньяль-Вейона.

Способ Виньяль-Вейона состоит в механической защите посевов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3-6 мм. Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку.' В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50° агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают агар в стерильные вей- оновские трубки. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Выращивание в таких трубках надежно защищает среду от атмосферного воздуха. Создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выделения изолированной колонии из трубки ее, соблюдая правила асептики, надрезают напильником на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производится путем его механического откачивания из специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Анаэростат (рис.82) представляет собой толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакууметром. Внутри находится этажерка или ведерко для размещения чашек 'Петри или пробирок с посевами. После размещения чашек воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса. Отрицательное давление доводят до 0,5-0,8 атм, после чего кран перекрывают, отъединяют анаэростат от насоса и переносят в термостат при 37°.

Рис.83. Стеклянный вакуумный эксикатор

Рис.82. Микроанаэростат

Замена воздуха индифферентным газом (азотом,водородом, аргоном, углекислым газом) может производиться в тех же анаэ- ростатах или эксикаторах (рис.83) путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростат,эксикатор) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия (Ka2S204) которые в щелочной среде способны поглощать большое количество кислорода.

При создании анаэробных условий следят за тем, чтобы в окружающей культуру среде содержалось некоторое количество углекислоты, которая необходима многим микроорганизмам. Например, пирогаллол рекомендуется растворять только в растворе соды, но не в едких щелочах, чтобы не происходило поглощение С02‘

Сосуд с восстановителем помещают в анаэростат рядом с чашками или пробирками с посевами. При использовании вакуумного ' эксикатора, реактивы, отнимающие кислород, можно поместить на дно эксикатора.

»*2S204 "552> >^2°3 ~55=> ““2s0*

Биологические методы основаны на совместном выращивании на одной чашке анаэробов е жадно поглощающими кислород аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шириной около I см. Получается два агаровых полудиска в одной чаше. На одну сторону агаровой пластинки засевают аэроб, например, часто используют St.aureus ИЛИ oerratia aarcescens.

На другую сторону засевают анаэроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размножаться аэробы. После того, как весь кислород в чашке будет ими использован, начнется рост анаэробов (на 3-4 сутки). В целях сокращения воздушного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированный метод основан на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

Цель работы: выделить из почвы чистую культуру анаэробных микроорганизмов по способу Виньяль-Вейона.

Материалы: образцы почвы, трубки Виньяль-Вейона,МПА.

Приготавливают взвесь почвы. Для этого I г образца почвы помещают в колбу емкостью 250 мл, содержащую 100 мл стерильной воды. Встряхивают на качалке 15 мин, дают отстояться 5 мин, чтобы осели крупные частицы. Получают таким образом разведение почвы 1:100. Разбавляют взвесь еще в 10;100 и 1000 раз, внося последовательно по I мл взвеси в пробирки с 9 мл стерильного физиологического раствора.

В пробирки с 10 мл расплавленного и охлажденного до 50°

о л

МПА засевают по 0,1 мл взвеси, разведенной до 1:10 , 1:10^ и 1:10®, быстро перемешивают и засасывают в стерильные трубки Виньяль-Вейона. Выращивают 24 часа при 37°. Под лупой или при малом увеличении микроскопа просматривают и описывают выросшие колонии. Пересевают микроорганизмы из'отдельных колоний на среду Китт-Тароцци, как это описано выше, выращивают при 37°. . Затем изучают подвижность микроорганизмов в препарате "раздавленная капля". Наблюдают особенности клеток в мазках, окрашенных по Граму и Цилю-Нильсену. Результаты опыта вносят в таблицу.

Некоторые морфологические особенности анаэробных микроорганизмов почвы Разведение

суспензии

почвы № 1 Форма колонии'колонии Подвижность

клеток Окраска по Граму Наличие

спор Рисунок 1:10001 и т.д. ... Литер ату р а

Большой практикум по микробиологии. Под ред. Г.Я.Селибе- ра. М., 1962.

Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии. М.,1974.

М е й н е л л Дж..МейнеллЭ. Экспериментальная микробиология. М., 1967.

П я т к и н К.Д. Микробиология с вирусологией и иммунологией. М., 1971.

<< | >>
Источник: Н.П.ЕЛИНОВ. МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМ ОСНОВАМ МИКРОБИОЛОГИИ . 1982. 1982

Еще по теме МЕТОДИ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТИХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ:

  1. 2.1. Систематика и номенклатура микроорганизмов
  2. Тема 4. ПИТАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕСРЕДЫ, ОСОБЕННОСТИ ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ.ДЫХАНИЕ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУРИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХМИКРООРГАНИЗМОВ
  3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов
  4. Методы выделения чистых культур аэробныхмикроорганизмов
  5. Методы культивирования и выделения чистых культуранаэробных микроорганизмов
  6. Тема 15. ПАТОГЕННОСТЬ И ВИРУЛЕНТНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ. ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ. МЕТОДЫ ЗАРАЖЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ. АНТИГЕНЫ, МЕТОДЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ. АНТИТЕЛА. РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ. ФАГОЦИТОЗ
  7. Тема 19. ЭШЕРИХИИ, САЛЬМОНЕЛЛЫ, ШИГЕЛЛЫ, ВИБРИОНЫИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ СЕМЕЙСТВАENTEROBACTERIACEAE
  8. Элективные методы культивирования
  9. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
  10. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ