<<
>>

Иммунологические методы

Существует множество методов качественного и количественного определения вирусоспецифических антител. С помощью этих методов можно обнаружить как IgM и IgG одновременно (реакция торможения гемагглютинации), так и отдельно иммуноглобулины каждого класса (IgG — радиальным гемолизом, a IgM — методом «захвата» IgM антител).

Как правило, в реакции связывания комплемента выявляются только вирусоспецифические IgG. Однако при тестировании этим методом микробиологических антигенов возможно одновременное опре- J деление специфических IgM и IgG. 1. Иммунологические методы используются главным образом в двух целях: во-первых, для диагностики текущей, завершившейся или врожденной вирусной инфекции и, во-вторых, для обнаружения специфических антител, присутствие которых указывает на прошедшую инфекцию и, следовательно, на иммунитет к возможной повторной инфекции. По силе иммунного ответа на вирусную инфекцию люди сильно отличаются друг от друга. На рис. 11.3 показана типичная кривая нарастания титра

Контакт

с больным Заболевание

Недели

Рис. 11.3. Динамика иммунного ответа на первичную инфекцию краснухи

антител в ответ на первичную инфекцию краснухи. Легко заметить, что установление диагноза краснухи возможно по нарастанию титра специфических IgG (сероконверсии) и выявлению специфических IgM (при этом суммарный титр специфических антител обоих классов возрастает в 4 раза). Присутствие специфических IgM в крови новорожденного свидетельствует о внутриматочном инфицировании, поскольку материнские IgM в отличие от IgG задерживаются плацентой. Специфические IgG, образовавшиеся в результате первичной инфекции, обычно сохраняются в течение всей жизни. Поэтому присутствие антител этого класса в сыворотке крови свидетельствует об иммунитете к соответствующей повторной инфекции.

Ниже приведены иммунологические методы обнаружения специфических антител к вирусу краснухи, особенно эффективные для диагностики заболевания плода и определения титра специфических антител в сыворотке крови.

Подробные описания методов, используемых для диагностики краснухи, можно найти в обзорах Паттисона [6] и Моргана-Капнера [7].

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Вирус краснухи вызывает гемагглютинацию эритроцитов многих видов животных. Чаще всего в РТГА используют эритроциты однодневных цыплят. Гемагглютинирующим (ГА) антигеном вируса краснухи при постановке этой реакции служит выращенный в культуре и обработанный Твин 80 и эфиром вирус. Предварительная обработка увеличивает ГА-титр вируса.

Стандартизация ГА-антигена вируса краснухи

1 мл 50%-ной суспензии эритроцитов цыплят трижды промывают в вероналовом буфере с декстраном и желатином (буфер DGV табл. 11.3) центрифугированием и ресуспендирова

нием осадка в 15-мл градуированной центрифужной пробирке. Отмытые клетки ресуспендируют в DGV-буфере для получения 30%-ной суспензии.

Таблица 11.3. Приготовление вероналового буфера с декстраном и желатином (DGV-буфер)

DGV-буферный раствор

Таблетки буфера для реакции 20

связывания комплемента

Веронал натрия 400 мг

Желатин 1200 мг

Дистиллированная вода 2000 мл

Растворяют таблетки в дистиллированной воде. Добавляют веронал натрия и желатин. Помещают в водяную баню при 56 °С до полного раство-рения желатина. Разливают во флаконы по 100 мл. Автоклавируют и хранят при 4 °С

25%-ный БСА

БСА, фракция 5 25 г

Стерильная дистиллированная 100 мл

вода

Стерилизуют фильтрованием, разливают по 1 мл в стерильные ампулы. Хранят при —20 °С

10%-ная глюкоза

Глюкоза 10 г

Дистиллированная вода 100 мл

Разливают по 1 мл. Автоклавируют и хранят при 4 °С

Для использования

DGV-буферный раствор 100 мл

25%-ный БСА 0,8 мл

10%-ная глюкоза 1,0 мл

Хранят при 4 °С

Разводят лиофилизированный препарат ГА-антигена вируса краснухи в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды.

В каждую из восьми лунок двух соседних рядов 96-луноч- иого полистиролового планшета для микротитрования с U-образными лунками вносят по 1 объему (0,025 мл) DGV (рис.

11.4, ряды 1 и 2, лунки 1—8). 12

1011

Номера лунок 5 6 7 8 е • ••••• • • • • •

2

3

Ряды 4

5

7

а

• »«»«**#*•** 00000000000»

000000000000

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Рис. 11.4. Полистироловый 96-луночный планшет для микротитрования

В первые лунки двух рядов вносят по одному объему ГА-антигена вируса краснухи.

Готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена вируса краснухи, начиная от 1 :2 и до 1 :256, используя 0,025-мл микротитратор. Перед употреблением головку микро- титратора следует прокалить в пламени докрасна, затем остудить в течение нескольких секунд, поместить в дистиллированную воду и промакнуть фильтровальной бумагой.

В каждую из заполненных лунок дополнительно вносят по одному объему DGV-буфера. В качестве контроля в лунки 12 первых двух рядов вносят по два объема DGV-буфера.

Суспензию отмытых эритроцитов цыплят разводят в 100 раз DGV-буфером, получая таким образом 0,03%-ную суспензию.

Во все 18 лунок добавляют по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов, готовый планшет закрывают другим, неиспользованным планшетом и инкубируют 1 ч при 4 °С.

На дне контрольных лунок образуется плотная «бляшка» неагглютинированных эритроцитов. Агглютинированные эритроциты оседают равномерно. ГА-титром считают обратную величину наибольшего разведения ГА-антигена вируса краснухи, при котором еще происходит полная агглютинация. Такое раз- ведение содержит 1 гемагглютинирующую единицу.

Для тестирования сывороток используют 4 ГА-единицы антигена вируса краснухи. Таким образом, если ГА-титр антигена равняется 32, то для обнаружения антител к вирусу краснухи его разводят DGV в восемь раз. Разведенный антиген стабилен в течение 25—48 ч при 4 °С.

Предварительная обработка сыворотки

Все сыворотки содержат неспецифические ингибиторы гемагглютинации, которые следует удалить. Неспецифические инги-биторы ГА в основном представляют собой липопротеины, от которых освобождаются, обрабатывая сыворотку каолином (см.

ниже). В сыворотках человека, кроме того, могут присутствовать неспецифические агглютинины куриных эритроцитов. Однако предварительная адсорбция тестируемых сывороток эритроцитами не является обязательной, поскольку все неспецифические гемагглютинины, присутствующие в сыворотках, обнаруживаются в контролях.

В стеклянные пронумерованные пробирки (75x12 мм) вносят по 0,2 мл сыворотки. Кроме исследуемых сывороток в каждом опыте необходимы положительные и отрицательные контроли.

В каждую пробирку добавляют по 0,8 мл 25%-ного каолина на боратно-солевом буфере (каолин предварительно промывают кислотой).

Содержимое пробирок взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин.

Отработанный каолин осаждают центрифугированием в настольной центрифуге при 2000 об/мин (примерно 800 g) 20 мин.

Супернатант переносят в чистые пронумерованные пробирки. В результате очистки получают сыворотки, разбавленные в четыре раза. Их используют для постановки реакции торможения гемагглютинации. Сыворотки можно хранить при 4 °С в течение ночи.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Для тестирования одного образца сыворотки вносят по одному объему DGV в один ряд лунок (лунки 1 —10 и 12).

В первую и последнюю лунки добавляют по одному объему сыворотки, разведенной в четыре раза.

С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки (в первой лунке 1 :8, в десятой 1 :4096).

В лунки 1—10 вносят по одному объему ГА-антигена краснухи, содержащего 4 ГАЕ. В лунку 12 (контроль сыворотки) ГА-антиген краснухи не добавляют.

В лунки 1—8 (рядов 1 и 2) другого планшета вносят по одному объему рабочего разведения ГА-антигена краснухи, и затем в восьми лунках готовят последовательные двукратные разведения ГА-антигена. В эти 16 лунок добавляют по одному объему DGV. Это титрование является проверочным для ГА-антигена краснухи. Для контроля в лунки 12 первого и второго рядов вносят по два объема DGV.

Закрытые планшеты оставляют на 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.

Во все заполненные лунки вносят по два объема 0,03%-ной суспензии эритроцитов цыплят и планшеты оставляют на 1— 1,5 ч (или на ночь) при 4 °С.

Просматривая планшеты, определяют титр ГА-антигена краснухи (он должен составлять 2—8 ГАЕ).

В контрольных лунках агглютинация не должна произойти.

Если же сыворотка агглютинировала эритроциты в отсутствие ГА-антигена краснухи, необходимо провести повторное тестирование исходного (четырехкратного) разведения сыворотки. Перед этим сыворотку адсорбируют одной каплей 30% -ной суспензии эритроцитов цыплят 1 ч при комнатной температуре, а затем эритроциты осаждают центрифугированием.

Титром специфических антител в исследуемой сыворотке считают обратную величину разведения, при котором полностью подавляется гемагглютинация.

Интерпретация результатов

При невысоком титре (а именно титре 8) интерпретировать результаты сложно, так как при небольшом разведении возможно остаточное присутствие неспецифических ингибиторов. Наличие вирусоспецифических антител считается доказанным при титре 16 или выше.

Реакция связывания комплемента (РСК)

Принцип реакции связывания комплемента (РСК) основан на том, что взаимодействие антител с вирусными антигенами приводит к активации, а следовательно, к связыванию комплемента. Остающийся комплемент можно обнаружить, используя эритроциты барана, сенсибилизированные антиэритроцитарными антителами. Эти антитела обычно называют гемолизинами и получают из сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Несвязавшийся (после первой реакции) комплемент вызывает лизис эритроцитов. В случае связывания комплемента в первой реакции лизиса эритроцитов барана (во второй реакции) не происходит.

Таким образом, количество специфических антител в сыворотке можно определить при тестировании ее последовательных разведений с известным микробиологическим антигеном в присутствии комплемента и с последующим добавлением сенсибилизированных эритроцитов барана.

Для получения достоверных воспроизводимых результатов необходимо строго соблюдать пропорции используемых реагентов. Поэтому перед постановкой реакции необходимо определить соответствующие концентрации комплемента, гемолитической сыворотки и антигена. Ниже мы приводим пример определения специфических антител к вирусу краснухи в РСК.

Титрование комплемента и гемолитической сыворотки

Здесь так же, как и в РТГА, используют полистироловые 96-луночные планшеты с U-образным дном и микротитратор (позволяющий работать с объемами 0,025 мл)

Постановка реакции

Растворяют в требуемом по инструкции объеме дистиллированной воды лиофилизированный препарат комплемента.

Нумеруют (от 1 до 8) восемь стеклянных пробирок (75 X ХІ2 мм).

Готовят 60-кратное разведение комплемента в первой пробирке.

Для этого 0,1 мл комплемента разводят 0,7 мл дистиллированной воды и 4,0 мл вероналового буферного раствора (VBS) (20 таблеток буфера для РСК растворяют в 2000 мл дистиллированной воды). Лиофилизированный комплемент содержит криопротектор, поэтому добавление 0,7 мл дистиллированной воды к 0,1 мл растворенного комплемента дает 10-кратное разведение.

В оставшиеся семь пробирок (2—8) вносят по 0,4 мл VBS.

1,6 мл содержимого первой пробирки переносят во вторую, перемешивают, затем из второй переносят 1,6 мл в третью и т.д. до восьмой пробирки. Перед каждым переносом пипетку промывают в VBS. Таким образом получают последовательные разведения комплемента с 20%-ной разницей между ними, т. е. 1:60, 1:75, 1:94, 1:118, 1:148, 1:184, 1:230, 1:288.

Размечают 96-луночный планшет, как указано на

рис. 11.5.

В лунки 1—8 рядов 1—7 вносят по два объема VBS.

В лунки 9 рядов 1—6 вносят по три объема VBS (конт

роль гемолитической сыворотки).

В лунки 1—8 рядов 1—7 добавляют по одному объему

приготовленных разведений комплемента.

Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4 °С.

Контроли

Комплемент гемолизина 60 75 94 118 148 184 230 288 25 0 0 0 0 2 4 4 4 4 • • • 50 0 0 0 0 1 3 4 4 4 • 9 • 100 0 0 0 0 0 2 4 4 4 0 Ф 0 Гемолизин 200 0 0 0 0 2 4 4 4 4 0 9 0 400 0 0 0 4 4 4 4 4 4 0 0т 800 4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 Контроли комплемента 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Ф00 Рис. 11.5. Титрование комплемента и гемолитической сыворотки: 0 — полный лизис; 1— лизировано 75% кл; 2 — лизировано 50% кл; 3 —¦ лизировано 25% кл; 4 — лизиса не происходит

На следующее утро готовят последовательные двукратные разведения гемолитической сыворотки от 1 :25 до 1 : 800; в особую пробирку вносят 1 мл VBS (контроль комплемента). В пробирку 1 вносят 2,4 мл VBS и 0,1 мл гемолитической сыворотки. По 1 мл VBS добавляют в пробирки 2—6. Из первой пробирки переносят 1 мл во вторую пробирку и т.д. до шестой пробирки, промывая пипетку после каждого переноса. Удаляют 0,5 мл из первой пробирки и 1 мл из шестой пробирки для того, чтобы объем жидкости в каждой пробирке составил 1 мл.

Эритроциты барана трижды промывают в VBS.

Затем супернатант сливают и эритроциты суспендируют в оставшемся объеме жидкости.

Определяют объем полученной суспензии эритроцитов и разводят ее VBS до получения 4%-ной суспензии.

По 1 мл суспензии эритроцитов добавляют в семь соответственно помеченных пробирок, следуемых за рядом пробирок с разведенной гемолитической сывороткой, а также в контрольную пробирку.

Суспензии эритроцитов смешивают с соответствующими разведениями гемолизина, закрывают пробирки и инкубируют 20 мин на водяной бане при 37 °С.

В то же время в термостате или термальной комнате разогревают приготовленный накануне планшет для микротитрования.

Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и по одному объему каждого разведения вносят в соответствующий ряд лунок.

Ресуспендируют содержимое лунок, постукивая по планшету, и оставляют его на 30 мин при 37 °С. Через 15 мин инкубирования необходимо повторно суспендировать клетки встряхиванием планшета.

Для получения окончательного результата планшет выдерживают примерно 90 мин при 4 °С.

Интерпретация полученных результатов. На рис. 11.5 показан типичный результат тестирования. Отсутствие гемолиза в контрольных лунках с комплементом и гемолизирующей сывороткой (гемолизином) свидетельствует об отсутствии неспецифического лизиса.

Оптимальной сенсибилизирующей концентрацией (ОСК) гемолитической сыворотки считают ее разведение, обеспечивающее наибольший лизис при максимальном разведении комплемента. На рис. 11.5 ОСК составляет 1 : 100. В описанных ниже опытах гемолитическую сыворотку используют именно в этом разведении.

Разведение комплемента, обеспечивающее 50%-ный лизис при ОСК гемолитической сыворотки содержит одну единицу комплемента (ЕКБО)- На рис. 11.5 EKso содержится в разведении 1 :184, поэтому для тестирования следует использовать комплемент в разведении 1 : 60.

Титрование связывающего комплемент (СК) антигена вируса краснухи с положительной контрольной сывороткой

Постановка титрования. 1. Разводят лиофилизированный СК-ан- тиген вируса краснухи дистиллированной водой до указанной в инструкции концентрации.

Нумеруют шесть пробирок (75X12 мм).

В пробирку 1 вносят 0,2 мл антигена вируса краснухи и 0,8 мл VBS.

В пробирки 2—6 добавляют по 0,5 мл VBS.

Из ^первой пробирки во вторую переносят 0,5 мл и т.д. до шестой пробирки, получая таким образом последовательные разведения антигена 1:5, 1 : 10, 1 :20, 1 :40, 1 :80, 1 : 160.

Разводят лиофилизированный препарат заведомо положи-тельной антисыворотки дистиллированной водой.

К 0,1 мл сыворотки добавляют 3,9 мл VBS (сыворотку разводят в 40 раз).

Готовят последовательные двукратные разведения анти-сыворотки на VBS (1 : 40, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320, 1 : 640).

Размечают полистироловый 96-луночный планшет, как показано на рис. 11.6.

В каждую лунку, содержащую контрольную антисыворотку (лунки 7 рядов 1—6), и в каждую лунку, содержащую контрольный антиген (лунки 1—7 ряда 6), вносят по одному объему VBS.

В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему соответствующего разведения сыворотки.

В лунки 1—6 рядов 1—5 добавляют по одному объему соответствующего разведения антигена.

В каждую лунку вносят по одному объему разведения, содержащего ЗЕКбо-

Для проверки правильности выбора концентрации комплемента в четыре контрольные лунки вносят 6, 3, 1,5 и 0,75 ЕКБО соответственно (ряды 1—4, лунки 12). Далее проводят следующие операции:

а) в лунки рядов 1, 3, 4 добавляют по одному объему VBS; в лунки ряда 2 — два объема VBS;

б) в лунки ряда 1 добавляют два объема комплемента, а в лунки рядов 2 и 3 — по одному объему комплемента;

в) с помощью микротитратора переносят 0,025 мл из лунок ряда 3 в лунку ряда 4;

г) из лунок ряда 4 микротитратором удаляют 0,025 мл;

д) в лунки рядов 3 и 4 вносят по два объема VBS.

Планшет оставляют на ночь при 4 °С.

Утром планшет выдерживают 30 мин при 37 °С.

Готовят 4%-ную суспензию эритроцитов барана; 2,5 мл этой суспензии смешивают с равным объемом гемолизина, разведенного в VBS до ОСК. Гемолизин добавляют при постоянном перемешивании, переворачивая пробирки 10—12 раз. Сенсибилизированные эритроциты инкубируют в водяной бане 30 мин при 37 °С.

В каждую использованную лунку планшета добавляют по одному объему сенсибилизированных эритроцитов.

Для перемешивания планшет покачивают, затем накрывают крышкой и инкубируют 15 мин при 37°С. Затем содер-- жимое лунок еще раз перемешивают, покачивая планшет, и продолжают инкубацию еще 15 мин.

Для получения окончательного результата планшет выдерживают около 90 мин при 4 °С.

Интерпретация полученных результатов. На рис. 11.6 показан типичный результат тестирования. Контроль комплемента свидетельствует о правильности выбора концентрации комплемента. Контроль антигена и антисыворотки (полный гемолиз в этих лунках) свидетельствует о том, что для связывания комплемента необходимо образование комплекса антигел — антитело.

Оптимальным разведением СК-антигена вируса краснухи считают разведение, обеспечивающее максимальное связывание комплемента при наибольшем разведении сыворотки. В нашем примере (рис. 11.6) таким разведением является разведение

Антиген Контроли

5 10 20 40 80 160 антисыворотки 1

О

О

о

о

о

о

2

4

о

о

о

о

о

о

о •

о •

О •

о •

о •

О 0

Контроля . номплемента

40

80

160

Антисыворотка

320

640

Контроля

антигена

4 4 4 4

4 4 4 3

0121 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0

1. Рис. 11.6. Титрование антигена и специфических антител

1 :20. Его и следует использовать при тестировании неизвестной сыворотки.

В рассматриваемом случае титр положительной сыворотки равен 160, т. е. обратной величине разведения, позволяющего различить два произвольных разведения СК-антигена вируса краснухи.

Тестирование неизвестной сыворотки

Титрование сыворотки. 1. В стеклянных пробирках готовят четырехкратные разведения исследуемой, контрольной положительной и контрольной отрицательной сывороток, смешивая 0,1 мл каждой сыворотки с 0,3 мл VBS.

Для инактивации присутствующего в сыворотке комплемента пробирки инкубируют на водяной бане 30 мин при 56 °С.

96-луночный планшет для микротитрования размечают, как указано на рис. 11.7.

В лунки 1—8 и 10 вносят по одному объему VBS. Количество заполненных рядов должно соответствовать числу тестируемых сывороток.

В лунки 1 и 10 добавляют по одному объему разведенной в четыре раза сыворотки.

Разведения сывороток Коитроли

8 16 32 64 128 256 512 1024 сывороток

Контроли

комплемента

Сыворотки

D

Рис. 11.7. Титрование неизвестной сыворотки в реакции связывания комп-лемента

С помощью микротитратора готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в первых восьми лунках. Таким образом получают последовательные двукратные разведения от 1 :8 до 1:1024. Из лунок 8 микротитр атором удаляют по 0,025 мл.

В лунку с контролем антигена добавляют один объем VBS, а в лунку с контролем клеток — три объема VBS.

По одному объему КС-антигена вируса краснухи добавляют в каждую лунку, за исключением тех, где содержатся контроли сывороток (лунки 10), клеток и комплемента.

Один объем разведения, содержащего ЗЕКБО, добавляют во все лунки, кроме лунок с контролем комплемента и контролем клеток.

Контроль комплемента готовят, как описано выше.

Планшет закрывают и оставляют на ночь при 4 °С.

Планшет выдерживают ЗО мин при 37 °С, а затем в каждую лунку добавляют сенсибилизированные эритроциты, как описано выше.

Планшет инкубируют при 37 °С, как описано выше. Перед учетом результатов планшет выдерживают 90 мин при 4° для осаждения клеток.

Учет полученных результатов. На рис. 11.7 показан результат тестирования четырех неизвестных сывороток. Контроль ком-племента подтверждает, что разведение комплемента действительно содержит ЗЕКБО- Контроль клеток свидетельствует об отсутствии спонтанного лизиса сенсибилизированных эритроцитов. Полный лизис в лунках, содержащих контроли антигена и сывороток, свидетельствует о том, что для связывания комплемента необходимо образование комплекса антиген — антитело. Поэтому, если сыворотки содержат иммунные комплексы и инфицированы бактериями, результат реакции может быть искажен. Контроль с заведомо отрицательной сывороткой свидетельствует об отсутствии иммунных антител. Контроль заведомо положительной сыворотки показывает, что она содержит антитела в разведении 1 : 128. В 256-кратном разведении антитела обнаружить не удалось. Таким образом, титр контрольной положительной сыворотки равен 128. Титры тестируемых сывороток от А до D составляют соответственно 8, 256, 16 и 64.

Радиальный гемолиз

Радиальный гемолиз — прекрасный метод для обнаружения IgG к вирусу краснухи [8], поскольку этим чувствительным и специфичным методом можно одновременно тестировать большое число сывороток (рис. 11.8).

IgG, специфичные к вирусу краснухи, обнаруживают по лизису эритроцитов, связанных с антигеном вируса краснухи и суспендированных в агарозном геле в присутствии комплемента.

Содержащиеся в сыворотке IgG к антигену вируса краснухи, связанному с эритроцитами, выявляют при одновременном тестировании контрольных гелей, содержащих комплемент и эритроциты, свободные от антигенов краснухи.

Приготовление гелей для радиального гемолиза

Расплавляют обычным образом два объема (по 15 мл) 1%-ной агарозы на буфере для постановки РСК и охлаждают до 43 °С в водяной бане.

Эритроциты барана трижды промывают центрифугирова-нием и ресуспендированием в том же буфере.

Рис. 11.8. Радиальный гемолиз, вызванный антителами к вирусу краснухи. Положительный контроль с низким содержанием специфических антител (15 международных единиц) — лунки 3 и 5 ряда 5, отрицательный контроль — между ними

Трижды промытые клетки опять ресуспендируют в том же буфере, получая 15%-ную суспензию. В две пробирки, обозначенные «опыт» и «контроль», вносят по 0,3 мл полученной суспензии.

Растворяют ГА-антиген вируса краснухи и смешивают с 0,3 мл суспензии эритроцитов в пробирке, обозначенной «опыт».

Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре.

Обе пробирки заполняют буфером для постановки РСК и центрифугируют для осаждения эритроцитов.

Супернатанты удаляют, а эритроциты ресуспендируют в 0,5 мл того же буфера с канамицином (100 мкг/мл).

Растворяют лиофилизированный препарат комплемента. В опытную пробирку добавляют 0,5 мл неразведенного комплемента.

Пробирку выдерживают 10 с в водяной бане при 43 °С, затем ее содержимое смешивают с 15 мл расплавленной (охлажденной до 43 °С) агарозой. Пробирку быстро закрывают пробкой и перемешивают содержимое для равномерного распределения эритроцитов, несколько раз переворачивая пробирку.

Сразу же после перемешивания смесь агарозы с эритроцитами выливают в горизонтально установленную квадратную пластиковую чашку Петри (100ХІ00 мм). Чашку обозначают «опыт».

Осторожным покачиванием равномерно распределяют агарозу по чашке Петри.

Для контрольной суспензии повторяют этапы 7—9. На соответствующей чашке делают надпись «контроль».

Чашки оставляют на 20 мин для затвердения агарозы. Результат учитывают сразу же, либо сохраняют чашки в течение четырех дней при 4 °С.

Тестирование сывороток

Тестируемые сыворотки прогревают 20 мин на водяной бане (60 °С) для инактивации комплемента.

В залитых гелях «опыта» и «контроля» по матрице с помощью узкой стальной трубки, присоединенной к водоструйному насосу, проделывают лунки диаметром 3 мм (рис. 11.9).

Соответствующие лунки опытного и контрольного гелей заполняют сыворотками. В каждую постановку следует включить как заведомо отрицательную, так и слабо положительную сыворотку (при диагностировании используют сыворотку, содержащую 15 международных единиц антител, специфичных к вирусу краснухи).

Гели помещают на ночь во влажную камеру при 37 °С.

Интерпретация полученных результатов

На пластинах с гелем против темного фона выявляют зоны гемолиза вокруг лунок. Сыворотки, вызывающие образование больших по сравнению с контролем зон гемолиза, содержат специфические антитела к вирусу краснухи. Сыворотки, не вызывающие гемолиза вообще или вызывающие образование зон гемолиза такого же диаметра, как и контрольных, не содержат специфических антител. Донор такой сыворотки восприимчив к первичной инфекции.

Рис. 11.9. Матрица для тестирования 63 сывороток (включая контроли) методом радиального гемолиза

Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи методом «захвата» антител

(antibody-capture technique)

Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи имеет важное значение при постановке диагноза первичной и врожденной инфекций. Существует множество методов определения и идентификации таких антител. В основе ранее применяемых методов лежит разделение сывороточных IgG и IgM гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученные фракции тестируют в РТГА на присутствие специфических иммуноглобулинов. В последнее время эти методы заменены чисто иммунологическими методами, которые не требуют фракционирования сыворотки. Существуют два основных варианта этих методов. Первый предполагает идентификацию иммобилизованного антигена. При этом антиген вируса краснухи связывают с поверхностью пластика (например, дном лунки 96-луночного планшета), инкубируют его с сывороткой пациентов, а затем с меченными антителами против IgM человека, содержащихся в исследуемой сыворотке. Если после каждой стадии проводить тщательную отмывку, то оставшаяся метка удажет на присутствие специфических IgM.

Альтернативным методом является метод «захвата» антител, при котором твердую фазу вначале связывают с антителами к IgM человека. Промывают и инкубируют с тестируемой сывороткой, что приводит к «захвату» содержащихся в ней IgM. Последующая инкубация с антигеном краснухи позволяет отобрать все специфические IgM. После очередной промывки связавшийся с твердой фазой антиген вируса краснухи выявляют в реакции с меченными антителами к вирусу краснухи.

Последние антитела — антитела-детекторы — могут быть помечены радиоактивным 1251 или связаны с ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Ниже мы опишем метод, основанный на использовании радиоактивных изотопов, поскольку он хорошо разработан и применяется в большинстве лабораторий. В качестве меченых антител в настоящее время широко используют мышиные моноклональные антитела, однако, к сожалению, они не всегда доступны. При необходимости мы советуем связаться с местной вирусологической лабораторией, которая смогла бы обеспечить вас моноспецифической сывороткой высокого титра. В противном случае сыворотка может быть получена стандартными методами (например, от кролика, иммунизированного вирусом краснухи, выращенным в клетках RK13) или с помощью гибридомной технологии (см. Теддер и др., [8]). Полученные антитела легко пометить иодом, как описано ранее [6]. Однако в последнее время все более популярным становится иммуноферментный метод. В частности, фирмой Rubenz-M производится коммерческий набор реагентов (Northumbria Biologicals) для метода «захвата» IgM, специфичных к вирусу краснухи. Кроме того, можно отдельно заказать моноклональные антитела к вирусу краснухи, конъюгированные с ферментом.

Подготовка полистироловых гранул

В контейнер помещают полистироловые гранулы (Northumbria Biologicals Ltd.), которые заливают кроличьей антисывороткой к р-цепям IgM человека (Dako Ltd.), разведенной в 500 раз в 1 н. НС1.

Гранулы встряхивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Перед употреблением гранулы должны быть выдержаны на холоду (4 °С) не менее 48 ч.

Для мелкомасштабных экспериментов гранулы разливают по 12-мм (в диаметре) пробиркам из полистирола. Гранулы промывают в специальном сосуде, удаляя жидкость пастеровской пипеткой, присоединенной с помощью вакуумного шланга 1. к водоструйному насосу. Описанные выше процедуры могут быть значительно упрощены при использовании специальных систем фирмы Abbott Diagnostics Ltd.

Тестирование

Отбирают требуемое количество гранул, отсасывают НС1 и покрывают гранулы PBSA с 1% БСА. Суспензию инкубируют 3 ч при комнатной температуре.

В лунки или пробирки, используемые для тестирования, разливают по 200 мкл PBSA с 0,05% твин 20 (PBST), затем в них добавляют по 5 мкл исследуемых и контрольных сывороток (каждая проба должна быть поставлена в двух параллелях). Смешанный препарат сывороток от 4—8 недавно выздоровевших больных принимают за 100 условных единиц IgM, специфичных к вирусу краснухи. Положительные контроли, со-держащие 40, 10, 3,3 и 1 условных единиц, получают, разводя смешанную сыворотку заведомо отрицательной человеческой сывороткой. Они используются в каждом тестировании для построения стандартной калибровочной кривой. Кроме того, в каждый опыт необходимо включать отрицательный контроль.

В каждую лунку или пробирку с приготовленным 40-кратным разведением тестируемых и контрольных сывороток добавляют гранулы, покрытые сывороткой кролика против р-цепей IgM человека. Образцы инкубируют 3 ч при 37 °С.

Гранулы трижды промывают PBST, а затем инкубируют с 200 мкл ГА-антигена вируса краснухи (титр 128), разведенного в 10 раз в PBST. Образцы инкубируют 18—24 ч при 4 °С. После инкубации гранулы трижды промывают в PBST.

В каждый образец добавляют по 200 мкл антител-детекторов, меченных 1251 и разведенных до 50 000 ими/мин на 200 мкл. Для разведения используют PBS с 2% твин 20, 20% кроличьей сыворотки и 10% заведомо отрицательной человеческой сыво-ротки (обе сыворотки инактивируют прогреванием при 37 °С в течение 3—4 часов).

Гранулы промывают четыре раза PBST и определяют радиоактивность с помощью (-счетчика. Далее усредняют результаты параллелей, вычитают счет фона и строят калибровочную кривую. Данные по контрольным сывороткам (счет за 100 с) наносят на логарифмическую бумагу (рис. 11.10). Количество относительных единиц в исследуемых сыворотках определяют, сравнивая построенную калибровочную кривую со стандартной калибровочной кривой.

Рис. 11.10. Стандартная кривая для определения специфичных к вирусу краснухи IgM методом «захвата» антител

Интерпретация полученных результатов

Сыворотка, содержащая 3,3 условной единицы и более 3,3, считается положительной. Данный результат свидетельствует о недавно перенесенной или врожденной инфекции. Сыворотка, содержащая менее 1 условной единицы, считается отрицательной. Сыворотка, содержащая от 1 до 3,3 условной единицы, не может считаться ни положительной, ни отрицательной. В этом случае диагноз ставится с учетом клинической картины заболевания. Как правило, такие сыворотки все же рассматриваются как отрицательные. Тем не менее они могут свидетельствовать об инфекции, перенесенной ранее.

Благодарности

Мы благодарны Джулиан Ходгсон и сотрудникам отдела вирусологии Kings College Hospital за помощь в отработке изложенных методов. Кроме того, мы благодарим Филлис Ловетт за подготовку текста к печати.

Литература

Lennette Е. Н„ Schmidt N. J., eds. (1979). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 5th Edition, published by American Public Health Association, Washington.

Grist N. R., Bell E. J., Follett E. A. C., Urquhart G. E. D. (1979). Diagnostic Methods in Clinical Virology, 3rd Edition, published by Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh and Melbourne.

Field A. M. (1982). Adv. Virus Res., 27, 1.

Gardner P. S., McQuillian J. (1980). Rapid Virus Diagnosis, 2nd Edition, published by Butterworths, London.

Paul J. (1975). Cell and Tissue Culture, 5th Edition, published by Churchill Livingstone Edinburgh, London and New York.

Pattison J. R., ed. (1982). Laboratory Investigation of Rubella Public Health Laboratory Service Monograph Series, No. 16, Her Majesty’s Stationery Office, London.

Morgan-Capner P. (1983). Public Health Lab. Serv. Microbiol. Digest, 1, 6.

Tedder R. S., Yao J. L., Anderson M. J. (1982). J. Hyg., 88, 335.

<< | >>
Источник: Баррет Т. и др.. Вирусология. Методы: В52 хи. — М.: Мир,1988. — 344 с.. 1988

Еще по теме Иммунологические методы:

  1. РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
  2. Иммунологические методы
  3. Методы определения гормонов
  4. ЛАБОРАТОРНЫЕ И ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖЕЛУДКА
  5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУННОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
  6. Методы исследования кишечника при запорах у детей
  7. Методы исследования поражений внутренних органов при наркомании
  8. 2.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
  9. Иммунологический метод
  10. Иммунологические методьі контрацепции
  11. ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ
  12. Глава 9 Иммунологические методы